异硫氰酸荧光素酯 FITC

中文名称：异硫氰酸荧光素酯
CAS号：3326-32-7
中文别名：异硫氰酸荧光酯异构体/FITC;FITC,荧光素-5-异硫氰酸盐异构体I;荧光胺异硫腈酸盐;荧光素-5-异硫氰酸盐异构体I;5-异硫氰酸荧光素酯;5-异硫氰酸荧光素;异硫氰酸荧光素(异构体I);异硫氰酸荧光素,ISOMER1
英文名称：Fluorescein isothiocyanate isomer I
英文别名：FITC;FITC-CELITE(R);FITC ISOMER;FITC 'ISOMER I';FITC, ISOMER I;FLUORESCEIN ISOMER I ISOTHIOCYANATE;FLUORESCEIN ISOTHIOCYANATE, ISOMER 1;FLUORESCEIN ISOTHIOCYANATE ISOMER I
EINECS:222-042-0
分子式：C21H11NO5S
分子量：389.38

产品简介

异硫氰酸荧光素（Fluorescein  Isothiocyanate），缩写FITC，是生物学应用最广泛的一种绿色荧光素衍生物，其异硫氰酸基团能与蛋白上的氨基末端和首胺反应，从而将荧光素标记到蛋白上，包括抗体和凝集素。FITC 的生物应用包括蛋白的荧光标记，蛋白的荧光示踪，以及荧光抗体的病原体快速鉴定技术。FITC的最大吸收波长为495nm，呈黄-橙色；最大发射波长为525nm，呈黄-绿色。

本品为FITC的I型异构体（Isomer I），纯度≥90%，适用于蛋白标记。

同义名：Fluorescein isothiocyanate isomer I; Fluorescein 5-isothiocyanate; 5-FITC (isomer I); 荧光素异硫氰酸酯异构体 I；荧光素 5-异硫氰酸酯；

外观：黄色至橙色或黄棕色粉末

溶解性：溶于丙酮（1mg/ml），DMSO（5mg/ml），微溶于水（＜0.1mg/ml）

储存条件：2-8ºC 密封干燥避光保存，有效期二年。

使用方法

1. FITC标记蛋白

1） 制备溶于 0.1M 碳酸钠缓冲液（pH 9.0）的待标记蛋白溶液，浓度≥2mg/ml。

【注意】：勿将碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液存放于 0-5℃超过 1 周，因 pH 值会发生变化，建议现配现用。

【注意】：待标记蛋白必须是未被污染蛋白，且蛋白溶液里不能含有叠氮钠或胺类试剂，如 Tris、甘氨酸， 因为这些试剂会抑制标记反应。如果缓冲液里含有上述试剂，则需将该蛋白溶液在 4℃于 PBS，pH 7.4 透析过夜；透析过程中如果 pH 值过高（＞8.0-8.5）会损害某些蛋白。

2） 溶解 FITC 于无水 DMSO 配制成 1mg/ml 的溶液。

【注意】：建议于每次标记实验前新鲜配置 FITC 溶液，避光保存。

3） 对于 1ml 蛋白溶液加入 50µl FITC 溶液，可按照每次 5µl 的量边加边轻轻搅拌蛋白溶液；

4） 待所需 FITC 加入完毕，将反应液于 4℃避光孵育 8h；

5） 加入 NH4Cl 使其终浓度至 50mM，4℃终止反应 2h；

6） 加入二甲苯青至浓度 0.1%，甘油至浓度 5%；

7） 通过大小孔径合适的凝胶过滤层析分离排除未被结合的 FITC，分离范围在 20,000 至 50,000（球蛋白例如抗体）。待凝胶柱平衡后，将以上反应混合液从柱顶注入，打开凝胶柱，待其全部流入柱床后，加入 PBS 缓冲液。

此时，可以形成两条带：a，快速移动带，也就是 FITC-蛋白标记物，先被洗脱，通常于室内光下可看到； b，慢速移动带，也就是未结合蛋白的 FITC 和二甲苯青。仅仅在 PBS 缓冲液清洗后被洗脱出来。

8） 于 4℃避光储存上述偶联物，加入 0.1%（w/v）叠氮化钠作为一种防腐剂。若蛋白浓度较低（＜1mg/ml），可加入 1%BSA 作为一种蛋白稳定剂。

9） 标记物中荧光素和蛋白的比值（F/P）可通过测定495nm 和280nm 处的吸光值来鉴定，F/P 应位于0.3-1.0。小于该比例则信号太低，高于该比例则背景太高。

2. 荧光素/蛋白摩尔比（F/P）的测定

F/P 摩尔比即蛋白荧光标记物中 FITC 与蛋白质的摩尔比。为了计算该值，首先需测定该标记物在 280nm 和495nm 的吸光值：将已标记蛋白样品置于石英比色皿中，测得 A280 和 A495，注意 A280 的值需在 0.2-1.4 之间，如在该范围外，需调整相应标记样品浓度。

1） 仅对 FITC-IgG 标记物

F/P 摩尔比计算公式为：Molar F/P=[2.77×A495] / [A280-（0.35×A495）]

FITC-IgG 标记物浓度计算公式为：IgG（mg/ml）=[A280-（0.35×A495）] / 1.4【注意】：此处 1.4，指的是大多数物种 IgG 以浓度为 1mg/ml 在 pH 7.0 的条件下测得的 A280 为 1.4。

【注意】：C 对一种蛋白质而言是一常数；

Mw 是蛋白质分子量；

389 是 FITC 的分子量；

195 是 FITC 偶联物在 pH13, 490nm 处的吸光值 E0.1%；

（0.35×A495）是基于 FITC A280 的校正因子；

E0.1%是某一蛋白（1.0mg/ml）在 280nm 处的吸光值。

注意事项

1） FITC有两种异构体：异构体I和异构体II，前者的异硫氰酸基团连接在苯环的C4位置，后者的异硫氰酸基团连接在苯环的C5位置，两种异构体在光谱上如波长或强度上难以区分。然而，异构体I比较容易分离和纯化，因此成本比较低，这也是为什么异构体I更普遍用于标记用的原因。FITC的两种异构体混合物适合大部分实验。

2） 本品对光、湿度和热敏感，请注意密封干燥、避光和低温保存。

3） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。