一步法TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒（绿色，AF488）

产品简介

细胞在发生凋亡时，会激活一些特异性的DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。使得凋亡细胞的DNA被切割成180~200bp片段，在琼脂糖凝胶上通常以180~200bp的阶梯状迁移。TdT酶（脱氧核糖核酸末端转移酶）将标记的dUTP连接到断裂DNA暴露的3'-OH末端，通过在这些末端添加FITC或Alexa Fluor 488 绿色荧光/Cy3红色荧光标记的dUTP的方式来标记晚期凋亡细胞，从而可以通过荧光显微镜或者流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法的检测细胞凋亡的原理。

保存及运输：-20℃避光保存，至少1年有效，避免反复冻融。

自备材料：PBS 缓冲液（pH~7.4）； 4%多聚甲醛（in PBS）； ⽜⾎清⽩蛋⽩ (BSA) 或正常的⽺、⽜⾎清； 70%⼄醇（⾃选）；脱蜡溶剂（⽯蜡切⽚样本）

使用方法

一、样品的准备：

1) 细胞样品的准备：

1.1) 可选：准备⼀份阴性对照样本（加⼊不含TdT酶的TUNEL反应液）。

1.2) PBS清洗细胞两次。

1.3) 细胞固定：加⼊适量 4% 多聚甲醛(pH 7.4)溶液，4℃放置30 min 。

1.4) PBS 清洗细胞两次。

1.5) 通透细胞：加⼊冰上预冷的70%⼄醇，在-20℃孵育 4 h。细胞能在70%⼄醇中-20℃的条件下保存⼀周。或者细胞可⽤配制于PBS中的 0.2% Triton X-100溶液通透，室温放置 20 min 。

1.6) PBS 清洗细胞两次。

2) 石蜡组织切片的准备： 

2.1）室温下⽤⼆甲苯浸泡⽯蜡组织切⽚2次，每次5 min，以彻底脱掉⽯蜡。【注】：⼆甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进⾏此操作。

2.2）室温下，将切⽚样本浸没于⽆⽔⼄醇中漂洗2次，每次5 min。

2.3）室温下，将切⽚样本连续浸没在不同浓度梯度的⼄醇（95%、90%、80%、70%）中，每种浓度各漂洗1次，每次 5 min。

2.4）室温下，将切⽚浸没于纯⽔中漂洗1次，每次3 min，再将切⽚浸没于1×PBS中漂洗1次，每次3 min，⽤滤纸⼩⼼吸⼲切⽚样本周围多余液体。

2.5）⽤免疫组化笔在切⽚样本周围描绘样品轮廓，以便下游通透与标记。

2.6）按1:100的⽐例，将2 mg/mL 的Proteinase K溶液⽤1 × PBS 稀释，使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加 100 µL 稀释好的Proteinase K溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育20 min。（Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进⾏优化）。

【注】：蛋⽩酶K可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切⽚脱落，所以要最优化孵育时间⻓短。时间⼀般为10~30 min，4 µm 左右的⽚⼦可以⽤10 min，但30 µm 左右的可⽤ 30 min。过长易脱⽚、过短起不到通透效果。

2.7）PBS 浸润清洗切⽚两次，每次5 min，⽤滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。【注】：这⼀步必须把蛋⽩酶K洗涤⼲净，否则会严重⼲扰后续的标记反应。

3) 冰冻组织切片样品的准备： 

3.1）将冰冻切⽚放置于室温的⽚架上，室温20 min，晾⼲。

3.2）将载玻⽚浸没在 4%多聚甲醛溶液（in PBS）中，室温固定30 min。

3.3）PBS浸润清洗切⽚两次，每次 5 min。

3.4）⽤滤纸⼩⼼吸⼲载玻⽚上样本周围的液体。

3.5）按1:100的⽐例，将 2 mg/mL 的Proteinase K溶液⽤1 × PBS 稀释，使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL 稀释好的Proteinase K溶液， 使溶液覆盖全部样本区域， 室温孵育10 min。Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进⾏优化）。

【注】：蛋⽩酶K可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切⽚脱落，所以要最优化孵育时间长短。时间⼀般为10~30 min，4 µm左右的⽚⼦可以⽤10 min，但30 µm 左右的可⽤ 30 min，需摸索最佳时间。过长易脱⽚、过短起不到通透效果。

3.6）PBS浸润清洗切⽚两次，每次5 min，⽤滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

4）阳性处理(仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行 TUNEL反应步骤)

4.1）按1:10 的⽐例⽤ ddH2O将 10 × DNase I Buffer稀释成1 × DNase I Buffer 备⽤。

4.2）滴加100 µL 1 × DNase I Buffer 到已通透的样本上，室温平衡5 min。

4.3）⽤1 × DNase I Buffer 以1:100稀释DNase I (2 U/μ L)， 使其为终浓度20 U/mL的⼯作液。

4.4）轻轻吸掉多余液体，加⼊100 μ L浓度为20 U/mL DNase I⼯作液，室温孵育10 min。

4.5）轻轻吸掉多余液体，PBS清洗样品2次

二、配制 TUNEL 检测液：

1)预先配制 TUNEL 反应混合液：每个样本需要已加⼊ 1 uL TdT 酶的 50 uLTUNEL 反应缓冲液。

2)每个样本加⼊ 100 μ L TUNEL平衡缓冲液，孵育5 min。

3)弃去平衡缓冲液，⽤滤纸⼩⼼吸去切⽚样本周围的多余液体，每个样本加⼊50 μ L TUNEL反应混合液。

a)贴壁细胞，⽤盖玻⽚使缓冲液均匀覆盖样本。37℃避光孵育 60 min。

b)悬浮细胞，可加⼊微孔板中，采⽤微孔板振荡器进⾏孵育或每隔15 min 温和的震荡反应管，使之充分反应。37℃避光孵

育60 min。

c)组织样本，⽤盖玻⽚使缓冲液均匀覆盖样本。将样本平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育2⼩时，湿盒底部铺⼀张含少量⽔的纸⼱保持湿度。37℃避光孵育2 h。

4. 去掉反应液，在1×PBS的染⾊缸中浸泡润洗2次，每次5 min。再使⽤适量配制于PBS 中的0.1% Triton X-100， 其中含 5 mg/mL BSA 的缓冲液清洗样本3次，每次5 min，以降低背景。
5. （可选）复染：每个样本滴加浓度为2 μ g/mL 的DAPI染液，避光室温孵育10 min。染⾊完后，轻轻去掉染液，并将样本在1×PBS中浸泡润洗3次，每次 5 min。
6. （可选）封⽚：将切⽚样本先纯⽔浸没 5 min，再放⼊70%⼄醇浸没 5 min，再80%⼄醇浸没5 min，90%⼄醇浸没5 min，95%⼄醇浸没5 min，⽆⽔⼄醇浸没5 min，最后将切⽚样本置于染⾊缸中以新鲜的⼆甲苯浸泡透明化处理2次，每次5 min。（通⻛厨中操作）。脱⽔完成后，擦去切⽚周围的液体，每个切⽚样本滴加50 μ L抗荧光淬灭封⽚液， 盖上盖玻⽚，⽤镊⼦的钝端轻轻敲击盖玻⽚，去除⽓泡以使封 ⽚完全。
7. ⽤荧光显微镜或流式细胞仪观察、分析，AF488是⼀种绿⾊荧光染料，激发波长、发射波长分别为485 nm，515 nm(凋亡细胞应被标记上明亮的绿⾊荧光，没有加⼊TdT 酶的阴性对照样本未被标记上荧光)。

注意事项

1）荧光染料均存在淬灭问题，保存和使⽤过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）如果使用蛋白酶K处理后，需充分洗涤出掉多余试剂。

3）所以试剂应避免反复冻融。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。